摘要：目的研究川芎内生真菌Alternariasp.IS代谢产物的化学成分。方法采用硅胶和葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱色谱、反相中压液相色谱、制备薄层色谱以及半制备高效液相色谱等分离技术，对川芎内生真菌发酵液的醋酸乙酯提取部位进行分离纯化，利用现代波谱学手段对分离的化学成分进行结构鉴定。结果从川芎内生真菌Alternariasp.IS代谢产物的醋酸乙酯提取部位分离得到1个新的内酯类化合物，鉴定为(+)-4,11-二羟基-2-十二烯-5-内酯。结论化合物1为首次从川芎内真菌中分离得到的新内酯化合物，命名为芎孢内酯A。
植物内生菌（Endophyte）包括细菌、真菌、放线菌等，是植物共生体系中的定殖微生物，存活于健康植物组织和器官内部，但不会引起直接、明显的致病症状[1]。研究发现，内生菌的次级代谢产物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等，具有潜在的药用价值[2]。目前，研究最多的内生微生物是细菌和真菌，其中植物内生真菌次级代谢产物研究已成为活性化合物筛选的1条新途径，也是天然药物化学研究的热点[3]。因此，植物内生真菌次级代谢产物已成为新化合物和新药物不可或缺的来源。
川芎LigusticumchuanxiongHort.是伞形科草本多年生植物，为著名川产道地药材，具有活血行气、祛风止痛的功效，被广泛用于偏头痛、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗[4-5]。近年来，关于川芎化学成分和药理作用的研究较多，而关于川芎内生真菌及其次级代谢产物的研究报道较少，研究主要体现在不同产地川芎内生真菌种群的差异[6]、川芎内生真菌的抑菌活性等方面[7]。课题组前期运用组织块法和分子生物学手段分离鉴定出川芎内生真菌Cladosporiumsp.IS，并采用现代色谱分离纯化技术从其次级代谢产物中分离获得了内酯类、甾体类、生物碱类化合物，发现cladospolideB、iso-cladospolideB抗菌作用明显[8]。为进一步研究川芎内生真菌次级代谢产物中的化学成分，本实验利用多种分离纯化手段，对川芎内生真菌Alternariasp.IS的次级代谢产物进行研究，得到1个新的内酯化合物，鉴定为(+)-4,11-二羟基-2-十二烯-5-内酯[(+)-4,11-dihydroxy-2-dodecene-5-lactone，1]，命名为芎孢内酯A。
1仪器与材料
1.1仪器
BúchiGradientFormerB-中压液相色谱仪（瑞士Welch公司，RpC18，40～60μm）；C18色谱柱（美国Agilent公司，mm×9.4mm，5μm，半制备型）；半制备型AgilentTechnologiesSeries高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BrukerAVIIIHD-核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；WatersSynaptG2高分辨质谱仪（美国Waters公司）；AntonPaarMCP旋光测定仪（美国AntonPaar公司）；AgilentcaryFT-IR（美国Agilent公司）；型电热恒温培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Milli-pore公司）；节能净化工作台（成都新光非兰特净化工程有限公司）；SANYOMLS-型实验用高压灭菌锅（日本SANYO公司）；ZWY-B型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
1.2材料
柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂，H硅胶，～目）；薄层色谱硅胶（GF硅胶，青岛海洋化工厂）；葡聚糖凝胶SephadexLH-20（瑞典AmershanPharmacia公司）；色谱甲醇（美国Sigma公司）；其他常规试剂均为成都市科隆化学品有限公司的分析纯试剂。
培养基：PDA固体培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂，用于分离，自制）；PDA液体培养基（马铃薯、葡萄糖、青霉素和硫酸链霉素U/mL，用于发酵，自制）。
川芎枝条于年6月采集于四川省成都市成都中医药大学温江校区药用植物园，由成都中医药大学药学院高继海副教授鉴定为川芎LigusticumchuanxiongHort.的枝条。
2内生真菌提取与分离
2.1内生真菌的分离
本实验采用课题组前期分离内生真菌Cladosporiumsp.IS的方法[8]，再次从成都中医药大学温江校区药用植物园采集2枝新鲜川芎枝条，先用纯水将表面洗净，其次用0.1%次氯酸钠溶液浸泡15min，用纯水反复清洗后，晾干并切成适宜大小的块状茎。然后于超净工作台内将块状茎放入75%乙醇中处理1～2min，用蒸馏水冲洗5～6次，再用无菌滤纸吸干后将表皮削去，将其切成10mm×10mm×2mm的小块，用无菌镊子将其置于PDA固体培养基内，共2个培养皿，每皿3～4个。封装后将培养皿置于恒温箱中培养3～15d，于28℃下培养并观察记录。与课题组前期分离鉴定出的川芎内生真菌Cladosporiumsp.IS形态类似[8]，菌落在PDA固体培养基上培养3d后，菌落直径可达2cm，表面呈墨绿色毛绒状，背面呈现深绿色，边缘全缘，中间凸起呈半球状，并在周围形成1个同心环。在观察到培养基上川芎组织块内部向周围长出菌丝并渐渐形成菌落时，采用尖端菌丝挑取法将单纯菌丝转移至新的培养皿，该过程重复6次，直至菌落呈现单菌落形态，即得内生真菌。
2.2内生真菌的鉴别
使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽取试剂盒进行菌株DNA提取，取1μL作为模板，进行18SrDNA基因扩增。18SrDNA的通用引物：NS1序列5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS6序列5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增反应参数：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。将PCR扩增产物用回收试剂盒纯化后，进行测序。将所测序列NCBI的GenBank数据库中进行BLAST比对分析。根据基因测序结果，通过18SrDNA、ITS、26S在NCBI数据库中数据进行比对，菌株的rRNA序列和Alternariasp.的相应序列同源性达到%，经鉴定从川芎中分离得到的内生真菌为Alternariasp.IS。
2.3内生真菌的发酵
将内生真菌Alternariasp.IS菌种接种到个锥形瓶中（mLPDA培养基/mL锥形瓶），在28℃、r/min振摇培养6d得到发酵液。
2.4发酵液的提取分离
将发酵液（15L）离心，得到上清液和菌丝体。将上清液用等体积醋酸乙酯萃取，重复3次，合并萃取液，减压蒸干浓缩得到醋酸乙酯部位4g。将菌丝体（50g）加入10倍量的甲醇进行超声提取0.5h，重复提取3次，离心得到上清液，减压蒸干溶剂，得到黄色浸膏，加入足量醋酸乙酯溶解，离心得到上清液，减压浓缩，即得到醋酸乙酯部位3g。将2次得到的醋酸乙酯部位合并，共得浸膏7g。
3单体成分的分离和鉴定
3.1提取分离流程
对醋酸乙酯萃取部位7g进行化学成分分离。首先使用反相C18硅胶柱色谱法，以甲醇-水（30∶70→∶0）梯度洗脱，根据TLC薄层检识结果，合并相同的组分，得到10个流分（Fr.A～J）。Fr.E（1.5g）加入1～1.5倍量的柱色谱硅胶（～目）拌样后，经硅胶（～目）柱色谱分离，石油醚-醋酸乙酯（∶1→5∶1）梯度洗脱，得到7个组分Fr.E1～E7。Fr.E4（mg，石油醚-醋酸乙酯30∶1洗脱部分）经SephadexLH-20柱色谱（石油醚-二氯甲烷-甲醇5∶5∶1洗脱）、制备薄层色谱（二氯甲烷-丙酮8∶1）分离后，最后经半制备高效液相色谱分离，甲醇-水（50∶50，1mL/min）为流动相，检测波长nm，分离得到化合物1（4mg，tR＝min）。
3.2结构鉴定
化合物1：无色油状液体。[α]25D+38.76°(c0.,CH3OH)。根据HR-ESI-MSm/z:.[M＋Na]+（计算值C12H20O4Na，.）确定化合物1的分子式为C12H20O4，不饱和度为3。IR光谱图显示该化合物含有羰基（cm?1）、羟基（cm?1）以及双键（cm?1）等特征信号。UV光谱显示该化合物的最大吸收波长在nm处。
化合物1的1H-NMR谱显示2个烯烃质子信号δ7.08(1H,dd,J=11.4,7.2Hz,H-3),6.09(1H,d,J=11.4Hz,H-2)，结合13C-NMR中的羰基碳信号δ.5(C-1),.0(C-2),.0(C-3)提示该化合物含有1个α,β-不饱和内酯结构片段。同时，1H-NMR谱显示3个连氧次甲基质子信号δ4.39(1H,m,H-5),4.09(1H,dd,J=7.2,3.6Hz,H-4),3.74(1H,m,H-11)。此外，δ1.35～1.45显示部分重叠的多个多重峰亚甲基信号，以及1个甲基信号δ1.17(3H,d,J=7.2Hz,H-12)。化合物1的13C-NMR谱给出12个碳信号，包括1个羰基、2个烯碳、3个连氧碳信号、5个亚甲基和1个甲基信号，根据文献比对，发现化合物1的核磁数据与(4R,5R)-4-hydroxy-5-methyl-2-hexen-5-olide[9]的数据类似，初步推断化合物1为脂肪族六元不饱和内酯类化合物。
为了准确确定其结构，进行了2DNMR实验。通过HSQC和1H-1HCOSY实验，对1H以及相应的13C信号进行了准确归属（表1）。化合物1的1H-1HCOSY谱显示H-2(δH6.09),H-3(δH7.08),H-4(δH4.09),H-5(δH4.39),H-6(δH1.40),H-7(δH1.38),H-8(δH1.35),H-9(δH1.37),H-10(δH1.45),H-11(δH3.74),H-12(δH1.17)依次相关，由此确定化合物1结构中存在质子之间相互偶合的结构片段（图1）。在HMBC谱中，H-2与C-1、C-4相关，H-3与C-1、C-5相关，H-4与C-6相关，H-5与C-7相关，H-6与C-8相关，H-7与C-9相关，H-8与C-10相关，H-9与C-11相关，H-10与C-12相关。综上，鉴定化合物1的结构为(+)-4,11-二羟基-2-十二烯-5-内酯。经Scifinder数据库检索，确定化合物1为新化合物，命名为芎孢内酯A。
4讨论
众所周知，细菌和真菌产生的次生代谢产物是抗菌药物和其他活性药物的重要来源[10]，自然界许多内生真菌存在于不同植物中，且与宿主长期进化中产生与宿主相同或类似的活性化合物[11]。数百种具有新颖结构的活性次级代谢产物已被报道，如生物碱、萜类、黄酮类、类固醇、内酯等[12-13]。其中，内酯类化合物具有显著的生物活性，如内生真菌AllantophomopsislycopodinaKS-97的代谢产物allantopyroneA和PenicilliumislandicumSopp.的代谢产物岛状酸-II甲酯对人早幼粒白血病HL-60细胞具有良好的细胞毒作用[14]。红树内生真菌Pestalotiopsissp.PSU-MA69的发酵产物pestalolide和seiridin对白念珠菌和新生念珠菌有抗真菌活性[15]。因此，对罕见的具有合成天然内酯化合物的微生物及其次级代谢产物进行鉴定和探索，将有助于微生物生产的长期可持续性发展。
本实验以川芎内生真菌Alternariasp.IS为目标菌株，开展了其发酵液醋酸乙酯提取部位化学成分研究，从中分离得到1个新颖的内酯化合物，该化合物是由羟基脂肪酸成环形成的六元内酯，为后续川芎内生真菌的研究提供了参考依据。
参考文献（略）
来源：李馨蕊，马川，郭力，刘娟，熊亮，周勤梅.川芎内生真菌次级代谢产物中1个新的内酯化合物[J].中草药,,50(20):-.
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