摘要：目的基于质量源于设计理念优化了丹参川芎嗪注射液前处理过程中丹参浓缩膏的石硫工艺。方法使用鱼刺图法对丹参浓缩膏石硫工艺涉及的各个参数进行了初步风险评估，筛选出了9个潜在关键工艺参数（criticalprocessparameter，CPP），即石灰乳质量分数、加石灰乳速度、搅拌速度、加石灰乳后搅拌时间、硫酸质量分数、加酸速度、加酸后搅拌时间、静置时间和静置温度。采用Plackett-Burman（PB）实验设计法对9个潜在CPP进行进一步筛选，确定了石灰乳质量分数、加石灰乳后搅拌时间、加酸后搅拌时间和静置时间为石硫工艺的CPP。采用中心复合实验设计法建立CPP和关键质量属性之间的偏最小二乘回归模型，根据石硫上清液中各指标需要达到的水平，通过计算获得基于概率的设计空间。结果推荐的石硫工艺操作空间为石灰乳质量分数12.0%～13.0%，加石灰乳后搅拌时间40～50min，加酸后搅拌时间30～35min，静置时间16～20h。结论在设计空间内进行操作有助于提高石硫工艺中间体质量一致性，本研究对实际工业生产具有一定参考价值。
丹参川芎嗪注射液（DanshenChuanxiongqinInjection，DCI）是由丹参素及盐酸川芎嗪配伍制成的复方制剂，临床上主要用于闭塞性脑血管疾病及其他缺血性心血管疾病[1-8]。DCI的制备工艺主要是将丹参饮片经过提取、浓缩、碱沉酸溶、醇沉等一系列的单元操作后获得丹参素含量较高的丹参提取液。碱沉酸溶处理法简称石硫法，是用石灰乳和硫酸处理中药水提液，从而制备中药注射剂的一种方法[9]。目前，石硫工艺优化方法尚未得到系统的研究，相应研究几乎未见报道，仅有沈金晶等[10]采用设计空间法优化了金银花水提液的石灰乳沉淀工艺，后续酸溶工艺仍待研究。质量源于设计（qualitybydesign，QbD）理念现已广泛应用于化学药和生物药生产工艺的研究开发[11]，QbD理念也在中药生产工艺研究中得到了应用[12-20]。本研究基于QbD理念，应用风险分析、试验设计等方法研究DCI制备过程中的石硫工艺，建立关键工艺参数（criticalprocessparameter，CPP）的设计空间。
1仪器与试药
1.1仪器
85-1磁力搅拌器，杭州仪表电机有限公司；XS、AB-N型电子分析天平、SevenMultipH型综合测试仪，梅特勒-托利多上海有限公司；SE型电子天平，奥豪斯仪器有限公司；Cary60型紫外-可见分光光度计，Agilent科技有限公司；Milli-Q型超纯水机，美国Millipore公司；JJ-IA型数显测速电动搅拌器，常州润华电器有限公司；BT-2J型蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司；J-26XPI型高速离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；DNP-型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Ultimate0型高效液相色谱仪，ThermoFisher科技有限公司；WatersAcquityTMUPLC超高效液相色谱仪，Waters科技有限公司；Agilent型高效液相色谱仪，配四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、ChemStation工作站，Agilent科技有限公司。
1.2试药
丹参提取液浓缩液，批号R，贵州拜特制药有限公司提供；对照品丹参素钠（salvianicacidAsodium，DSS，批号）、原儿茶醛（protocatechuicacid，PA，批号）、迷迭香酸（rosmarinicacid，RA，批号）、紫草酸（1ithospeIxnicacid，LA，批号）、丹酚酸B（salvianolicacidB，SaB，批号）、丹酚酸A（salvianolicacidA，SaA，批号）均购自上海融禾医药科技有限公司；氢氧化钙（批号）、硫酸（批号）、D-葡萄糖对照品（批号），均购自国药集团化学试剂有限公司；苯酚，批号B，美国阿拉丁工业公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸为色谱纯，购自德国Merck公司；去离子水由纯化水系统（Milli-QSynthesis，Millipore公司）制备得到。
2方法
2.1丹参石硫工艺操作流程
准确称取丹参提取液浓缩液.0g于mL烧杯中，用蠕动泵以设定的速度向浓缩液中加入设定质量分数的石灰乳（石灰乳加入量以氢氧化钙计，共含氢氧化钙30g），过程中使用电动搅拌器将料液以设定速度持续搅拌。加入石灰乳后继续搅拌一定的时间使料液混合均匀并充分反应。搅拌结束后向碱沉反应液中以设定的速度滴加设定质量分数的硫酸溶液（硫酸溶液加入量以硫酸计，共含硫酸40.14g），加酸结束后再搅拌相应的时间使料液混合均匀并充分反应。将结束搅拌后的反应混合物置于恒温培养箱中以设定温度静置一定的时间，此后将混合物置于r/min的高速离心机内离心15min，获得上清液即为石硫工艺样品。
2.2工艺风险分析
采用鱼刺图法筛选潜在CPP。鱼刺图法分析丹参提取液的石硫工艺如图1所示。从图1可看出，影响石硫过程的工艺参数主要涉及以下几个方面：酸碱、环境以及工艺操作方式。根据实际生产经验分析和预实验结果，初步筛选出石灰乳质量分数（x1）、加石灰乳速度（x2）、搅拌速度（x3）、加石灰乳后搅拌时间（x4）、硫酸质量分数（x5）、加酸速度（x6）、加酸后搅拌时间（x7）、静置时间（x8）和静置温度（x9）9个潜在CPP。
2.3工艺关键评价指标的选择与分析方法
选择单位石硫工艺样品中6种含量较高的酚酸（DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA）含量、总糖含量以及总固体含量作为工艺的关键评价指标。
2.3.1各丹参酚酸含量分析方法DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA含量的分析采用HPLC与紫外检测器联用（HPLC-UV）法。
（1）混合对照品储备液的制备：分别精密称取DSS、PA、RA、LA、SaB和SaA对照品适量，加含2%甲酸的20%甲醇水溶液溶解，制成混合对照品储备液，储备液中DSS、PA、RA、LA、SaB和SaA的质量浓度分别为1.、1.、1.、0.、0.、1.mg/mL。
（2）供试品溶液的制备：精密称取石硫工艺样品1.0g于10mL量瓶中，用含2%甲酸的20%甲醇水溶液稀释至刻度，混匀，0r/min离心10min，取上清液即为供试品溶液，备用。
（3）HPLC分析条件：色谱柱为WatersCortecsTMC18柱（mm×4.6mm，2.7μm）；以0.4%甲酸水溶液为流动相A，0.4%甲酸乙腈溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～10min，2%～9%B；10～23min，9%～16%B；23～36min，16%～19%B；36～46min，19%～23%B；46～51min，23%～40%B；51～52min，40%～90%B；检测波长nm；体积流量0.8mL/min；进样量3μL；柱温40℃。色谱条件见图2。
（4）线性关系考察：用含2%甲酸的20%甲醇水溶液逐级稀释对照品储备液，制成质量分数分别为其30%、21%、11.5%、3.3%、1.1%的混合对照品溶液，0r/min离心10min，取上清液按HPLC-UV分析条件进行测定，以峰面积为纵坐标（Y），质量分数为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程：DSSY＝.X＋10.，r2＝1.，线性范围23.16～8.00μg/mL；PAY＝.X＋0.，r2＝1.，线性范围1.67～.70μg/mL；RAY＝.X－0.，r2＝0.，线性范围1.69～.10μg/mL；LAY＝.X－0.，r2＝0.，线性范围1.21～.70μg/mL；SaBY＝.X－2.，r2＝0.，线性范围1.75～.30μg/mL和SaAY＝.X－5.，r2＝0.，线性范围1.12～99.80μg/mL。
（5）进样精密度试验：精密吸取混合对照品储备液，连续进样6次，按HPLC-UV分析条件进行测定，记录HPLC-UV色谱峰面积，得到DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA6种化合物峰面积的RSD分别为0.19%、0.16%、0.18%、0.22%、0.26%、0.38%，表明仪器精密度良好。
（6）日内精密度试验：制备6份供试品溶液，按HPLC-UV分析条件进行测定，记录HPLC-UV图，并计算供试品溶液中6种化合物的质量分数，得到DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA6种化合物质量分数的RSD分别为0.15%、0.16%、0.96%、0.37%、0.32%、0.18%，表明日内精密度良好。
（7）稳定性试验：制备1份样品溶液，室温下放置0、2、5、7、10、12、15、17、20、25h分别进样分析，记录HPLC-UV图，并计算供试品溶液中6种化合物的质量分数，得到DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA6种化合物质量分数的RSD分别为0.12%、0.64%、0.40%、0.52%、0.51%、1.08%，表明供试品溶液在室温下25h内稳定。
（8）重现性试验：制备9份样品溶液，分别于3台不同的高效液相色谱仪AgilentHPLC、WatersUPLCAcquityTM、ThermosUltimate0UHPLC上进行分析，记录HPLC-UV图，使用随行标准曲线计算丹参提取液中DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA6种化合物的质量分数，结果其RSD分别为1.13%、1.51%、1.07%、3.15%、1.88%、0.50%，说明该方法的重现性良好。
（9）加样回收率试验：分别精密量取9份已测定的同一批次石硫工艺样品0.5mL于10mL量瓶中，分别加入相当于样品中各指标成分质量分数80%、%、%的对照品溶液各3份，用含2%甲酸的20%甲醇水溶液稀释至刻度。按HPLC-UV分析条件进行测定，记录HPLC-UV图，计算质量分数并计算加样回收率。DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA的平均加样回收率分别为.2%、.5%、.9%、.9%、.5%、.7%，RSD分别为0.92%、0.87%、2.05%、0.97%、0.71%、1.01%。
（10）样品测定：精密称取石硫工艺样品1.0g用含2%甲酸的20%甲醇水溶液稀释至10mL，混匀，0r/min离心10min，按HPLC-UV分析条件进行测定，使用随行标准曲线计算丹参提取液中DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA6种化合物的质量分数。
2.3.2固形物含量测定方法称取上清液适量，置于已干燥至恒定质量的称量瓶中，于℃烘箱内干燥至恒定质量，称定其质量[21]，计算上清液固形物含量。
上清液固形物含量＝恒质量后固体质量/样品质量
2.3.3总糖含量测定方法采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[21]。
2.3.4物质含量计算丹参提取液浓缩膏经石硫工艺处理后上清液所含的6种酚酸总量、总固体量以及总糖量分别按照以下公式计算。
酚酸总量＝上清液酚酸含量×上清液总质量/浓缩液总质量
总固体含量＝上清液固形物含量×上清液总质量/浓缩液总质量
总糖含量＝上清液总糖含量×上清液总质量/浓缩液总质量
2.4Plackett-Burman（PB）实验筛选CPP
2.4.1试验设计采用PB设计考察上述9个潜在CPP（x1～x9）对石硫工艺的影响，从而筛选出CPP。各个参数及参数的设定水平见表1，其中参数水平是根据实际生产的可操作范围确定；筛选试验中各实验的具体工艺条件见表1。
2.4.2PB实验工艺参数筛选数据处理采用加权多元线性回归系数法[22]筛选对结果影响较大的参数。该方法的步骤：第一，将CPP的评价指标按公式（1）进行标准化处理；第二，建立工艺参数和评价指标之间的多元线性回归模型，模型用公式（2）表示；第三，考虑到丹酚酸为丹参提取物的主要活性成分，因此在筛选CPP时重点考虑各工艺参数对各类酚酸的影响，以各酚酸在标准样品（此处为实验的中心点）中的含量作为权重，其与相关系数的乘积作为该指标调整后的相关系数（adjustedcorrelationcoefficient，ACC），以同一工艺参数在各指标模型中ACC的绝对值之和，综合评价该工艺参数对生产工艺的影响程度。
Y′＝(Y－)/s（1）
Y为关键工艺评价指标的测量值，Y′为关键工艺评价指标标准化后的值，为该评价指标的平均值，s为该评价指标的标准差
a0是常数项，xi为工艺参数的水平值，ai为该工艺参数的偏回归系数
通过以上的计算方式，能将对酚酸含量影响较大的工艺参数筛选出来，继而进行后续的工艺优化试验。
2.4.3PB筛选实验结果单位浓缩液经石硫法处理后各物质含量如表1所示。各指标相应的回归系数及权重系数见表2，其中，对指标模型影响不显著的回归系数未在表中列出。由表2可知，总固体与总糖在石硫工艺中的变化仅受石灰乳质量分数与静置时间的影响，其他各工艺参数均在一定程度上影响了酚酸含量在工艺过程中的变化。从表3可知，x1、x4、x7、x84个参数的调整后回归系数绝对值之和大于其他工艺参数，即这4个参数会对石硫工艺中酚酸的变化有显著影响，其中x1及x8对工艺中固形物及总糖的变化也有显著影响。因此本研究将x1、x4、x7、x8这4个工艺参数视作石硫工艺的CPP，并设计实验对其进行进一步的优化研究。这一筛选结果与沈金晶等[10]所报道的一致。
2.5CPP的优化
2.5.1关键质量属性（criticalqualityattribute，CQA）的确定由表1可知，总糖含量占总固体含量的50%左右，两者变化规律一致，总固体量的变化在一定程度上可以代表总糖量的变化，因此优化实验中不再将总糖含量列入CQA。
石硫工艺中，丹参水提浸膏经石灰乳处理后，体系pH值达到12～13，此时SaB发生大量降解，同时伴随SaB降解产物如DSS的大量形成[23]。如图3所示，丹参水提浸膏中主要含有的物质为SaB；经石硫法处理后，样品中DSS及PA、LA等成分的峰面积占比显著提高，而SaB的峰面积占比相较于提取液而言显著降低，证明石硫工艺导致丹参水提浸膏中各类酚酸的组成发生了较大的改变。因此优化实验引入Pearson相关系数（RP）作为CQA之一。
综上所述，选择单位石硫工艺样品中的6种酚酸（DSS、PA、RA、LA、SaB、SaA）的含量、总固体含量和RP作为石硫工艺样品的CQA。
2.5.2实验设计采用中心复合设计（central
