浙医院
在衰老过程中，神经元似乎特别容易受到神经退行性影响。迄今为止，在成熟的啮齿动物大脑中已显示出各种N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）-谷氨酸受体拮抗剂（异丙酚，咪达唑仑，异氟烷，七氟醚和地氟烷）或氨基丁酸A型受体激动剂（氯胺酮，MK-和PCP）的神经变性作用。七氟醚广泛用于全身麻醉的诱导和维持，具有起效快，消除迅速，并带有甜味的优点。目前的证据表明七氟醚不仅会抑制神经元生长、分化和突触形成，而且还会以时间和浓度依赖性的方式损害认知、学习和行为能力。这些作用的潜在机制可能涉及活性氧（ROS）介导的压力和信号传导、神经发生异常、神经源性生长/营养信号传导或直接神经元调节。课题组以前的研究表明，七氟醚暴露不仅可诱导海马神经元自噬，还可激活其细胞凋亡。自噬可能在七氟醚引起的神经毒性中起重要作用。但是，七氟醚对神经元的神经退行性作用的具体机制尚未阐明。自噬是减少七氟醚诱导的凋亡还是促进非凋亡程序性细胞死亡还有待研究。川芎嗪（TMP）是从伞形植物女贞属植物的生物碱中分离出的活性单体，有神经保护作用，现已广泛用于闭塞性脑血管疾病如脑供血不足，脑血栓形成和脑栓塞等的临床治疗。研究发现TMP可增强下丘脑中LC3II/I、pAMPK、mTOR和ULK1以及纹状体中pAMPK、mTOR、ULK1、Beclin1和Bax的表达，证明TMP在大鼠下丘脑和纹状体缺血再灌注损伤中发挥保护作用。该机制涉及将神经元从伤害性细胞凋亡转移到保护性自噬，并减少神经元Ca2+，更重要的是，除了上游ERK1/2和PI3K/Akt信号通路外，转录因子特异性蛋白1（Sp1）和核因子Y（NF-Y）还参与调节人SH-5Y5Y神经母细胞瘤细胞分化过程中TopoⅡβ的表达。有趣的是TMP可通过减少活性caspase-3和Bax的表达，增加Bcl-2的表达减轻布比卡因导致的SY5Y细胞凋亡，通过提高LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1水平，诱导SH-SY5Y细胞自噬。此外，TMP通过上调总GS和SOD的水平以及下调MDA的水平减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤。总之，TMP可能通过抑制SH-SY5Y细胞凋亡和诱导其自噬而发挥神经保护作用。然而TMP在七氟醚诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性中是否发挥保护作用仍不明确，值得进一步研究。GPR50，也被称为褪黑激素相关受体，几乎只在哺乳动物中发现，是一个孤儿受体，没有已知的内源性配体。GPR50高表达于下丘脑、垂体和蓝斑，这些核团在调节压力和焦虑相关疾病中起关键作用。CREB是cAMP反应元件结合蛋白，是一种G蛋白偶联受体（GPCR）信号激活的转录因子，与许多生物过程的调控有关。用利福平预处理可提高SH-SY5Y细胞活力和pCREB的表达，增强Akt磷酸化，抑制GSK-3β的活性，提示利福平部分通过PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信号通路提供神经保护作用，抵抗多巴胺能变性。BACE1是神经元的主要分泌酶，由Aβ产生；它在溶酶体中降解，是一种含有两个活性位点的跨膜蛋白，可以在细胞外形成二聚体。令人惊讶的是，BACE1还是一种重要的天冬氨酸蛋白酶，可在周围神经细胞中形成髓鞘。七氟醚可以通过减少AKT信号通路的激活来诱导神经细胞凋亡并增加caspase-3，caspase-9，Bax，BACE1，APP和Aβ蛋白表达。在突变人类APP神经元中诱导的自噬增强了远端轴突中BACE1的自噬保留，从而导致APP的β裂解增强。该表型可以被促进BACE1运输到溶酶体进行降解的Snapin增强的逆向运输所逆转。然而目前尚不清楚GPR50和CREB在七氟醚诱导的神经毒性以及TMP的神经保护中的作用。最近来自浙江大学医院麻醉科的陈新忠教授团队，通过Westernblot、RT-qPCR、siRNA细胞转染技术等方法，探讨了GPR50和CREB在七氟醚诱导的神经毒性中的作用以及TMP对七氟醚诱导的SH-SY5Y细胞中自噬，凋亡以及BACE1和Aβ表达的影响。该研究结果已刊发于年5月的《AmJChinMed》（IF=3.68）杂志上。材料与方法细胞培养SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）购自中国科学院上海生物技术研究所细胞资源中心。SH-SY5Y细胞在37°C的潮湿培养箱于5％CO2的培养基中（43.5％MEM，43.5％F12、10％FBS，1％GlutaMAX，1％丙酮酸钠和1％NEAA）培养。每隔一天更换一次培养基。药物处理SH-SY5Y细胞培养7天后，通过计算机产生的随机数分为7组（n=12）。将每组细胞培养瓶置于维持在37℃的麻醉诱导室中，该室包含新鲜气体（21％O2、5％CO2和69％N2）（C组）或另外添加3.4％七氟醚的新鲜气体，分别处理2h（S2h组），4h（S4h组）和6h（S6h组）。雷帕霉素组（R组）接受终浓度为nM的雷帕霉素，6h后暴露于3.4％七氟醚中6h。3-MA组（M组）在接受终浓度为10mM的3-MA后6h和TMP后暴露于3.4％的七氟醚中6h。TMP组（T组）在接受最终浓度为μmol/l的TMP24h后暴露于3.4％的七氟醚的6h。通过Capnomac气体监测仪进行监测，使七氟醚浓度稳定在3.4％，流速1L/min。mRFP-GFP-LC3表达质粒瞬时转染根据说明书，将mRFP-GFP-LC3质粒转染到细胞中。转染后，将细胞暴露于3.4％七氟醚或新鲜气体6小时。然后在共聚焦显微镜下观察每个细胞中红色点（自溶酶体）和黄色点（自噬体）的数量，观察6个不重叠的区域，并且每组至少计数20个细胞。siRNAAtg5和siRNAGPR50瞬时转染根据说明书，使用Lipofectamine0将siRNAAtg5和siRNAGPR50转染到细胞中。转染后，将细胞暴露于3.4％的七氟醚或新鲜空气中5h，并通过Westernblot和QRT-PCR检测LC3、BACE1和Aβ水平。数据分析采用SPSS24.0进行统计学分析，所有数据用均数±标准差表示。计量资料包括BECN1mRNA、Atg5mRNA、BACE1mRNA、β-APPmRNA、GPR50、CREB、pCREB、Atg5、Beclin-1、LC3B、Bax、Bcl-2、BACE1和Aβ的蛋白水平，采用学生t检验。Student’st检验还用于分析每个细胞中BACE1阳性表达、红色点（自噬溶酶体）和黄色点（自噬体）的数量，以及各组之间的细胞凋亡率。p0.05为差异有统计学意义。结果七氟醚激活SH-SY5Y细胞的自噬使用WB分析七氟醚暴露后SH-SY5Y细胞中自噬蛋白标记Beclin-1、Atg5和LC3-Ⅱ的表达。结果表明，S2h和S4h组的Beclin-1、Atg5和LC3-Ⅱ蛋白水平显著高于对照组（p0.05）（图1A和1B）。S6h组的Beclin-1、Atg5和LC3-Ⅱ蛋白水平显著低于S4h组（p0.05）（图1A和1B）。通过QRT-PCR测定七氟醚暴露后Beclin-1和Atg5mRNA的表达。结果表明，S2h和S4h组中Beclin-1mRNA和Atg5mRNA的水平显著高于对照组（p0:05）（图1C）。S6h组中Beclin-1mRNA和Atg5mRNA的水平显著低于S4h组（p0:05）（图1C）。为了实时监测自噬的发生，使用转染了RFP-GFP-LC3表达质粒的SH-SY5Y细胞评估了七氟醚暴露后，mRFP-GFP-LC3质粒在SH-SY5Y细胞中的表达。结果表明，S2h和S4h组中各SH-SY5Y细胞中红色点（自溶酶体）和黄色点（自噬体）的数量明显多于对照组（p0.05）（图1D和1E）。S6h组中各SH-SY5Y细胞中的红色点（自溶酶体）和黄色点（自噬体）数量显著少于S4h组（p0.05）（图1D和1E）。图1七氟醚诱导SH-SY5Y细胞凋亡使用蛋白质印迹分析来进一步评估SH-SY5Y细胞暴露于七氟醚后凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果表明，S4h和S6h组中Bax蛋白水平显著高于对照组（p0.05），而S4h和S6h组中Bcl-2蛋白水平显著低于对照组（p0.05）（图2A）。这些蛋白质组学变化与七氟醚暴露的持续时间呈线性相关。通过膜联蛋白V-FITC/PI染色和流式细胞仪分析SH-SY5Y细胞的凋亡率。结果表明S2h、S4h和S6h组中SH-SY5Y细胞的凋亡率（包括早期和晚期凋亡）显著高于对照组（p0.05）（图2B和2C）。自噬激活减弱七氟醚诱导的SH-SY5Y细胞凋亡为了确定增强自噬是否能减弱七氟醚诱导的凋亡，采用蛋白质印迹分析，检测接受雷帕霉素（nM）后暴露于七氟醚的SH-SY5Y细胞中Bax和Bcl-2的表达。结果表明，雷帕霉素组的Bax蛋白水平显著低于S6h组（p0.05），而Bcl-2蛋白水平显著高于S6h组（p0.05）（图2D）。图2七氟醚增加SH-SY5Y细胞中BACE1和A?的表达使用蛋白质印迹分析七氟醚暴露后SH-SY5Y细胞中BACE1和Aβ的表达。结果表明，S6h组的BACE1和Aβ蛋白水平显著高于对照组（p0.05），而S2h和S4h组的BACE1和Aβ蛋白水平显著低于对照组。那些在对照组（p0.05）（图3A）。使用QRTPCR确定七氟醚暴露后BACE1和AβmRNA的表达。结果表明，S2h和S4h组中BACE1和AβmRNA的水平显著低于对照组（p0.05）。S6h组中BACE1和β-APPmRNA的水平显著高于对照组（p0.05）（图3B）。为进一步观察七氟醚对BACE1的影响，采用细胞免疫荧光染色定量检测SH-SY5Y细胞中BACE1的表达。结果表明，S6h组中BACE1阳性细胞（细胞质中含有绿色点）的数量明显多于对照组（p0.05）（图3C）。图3TMP增强七氟醚诱导的自噬使用蛋白质印迹分析TMP处理后暴露于七氟醚的SH-SY5Y细胞中自噬蛋白标记Beclin-1、Atg5和LC3-Ⅱ以及相关信号通路蛋白GPR50、CREB和pCREB的表达。结果表明，T组的Beclin-1、Atg5、LC3-Ⅱ、GPR50和pCREB蛋白水平显著高于S6h组（p0.05）。在T组和S6h组之间，CREB蛋白水平没有显著差异（p0:05）（图4A，4B和4E）。使用QRT-PCR确定TMP处理并暴露于七氟醚后其Beclin-1和Atg5mRNA的表达。结果表明，T组中Beclin-1和Atg5mRNA的水平显著高于S6h组（p0.05）（图4C）。为了实时监测自噬的发生，采用瞬时转染RFP-GFP-LC3表达质粒的SH-SY5Y细胞，评估了七氟醚暴露后，mRFP-GFP-LC3质粒在SH-SY5Y细胞中的表达。结果表明，T组各SH-SY5Y细胞中红色点（自溶酶体）和黄色点（自噬体）的数量显著高于S6h组（p0.05）（图4D和4F）。图4TMP减轻了七氟醚诱导的凋亡使用蛋白质印迹分析进一步评估TMP处理并暴露于七氟醚后SH-SY5Y细胞凋亡蛋白标记Bax和Bcl-2的表达。结果表明，T组中Bax蛋白水平显著低于S6h组（p0.05），而Bcl-2蛋白水平显著高于S6h组（p0.05）（图5A）。采用膜联蛋白V-FITC/PI染色和流式细胞仪分析SH-SY5Y细胞的凋亡率。结果表明，T组中SH-SY5Y细胞的凋亡率，包括早期和晚期凋亡，均显著低于S6h组（p0.05）（图5B和5C）。TMP通过增强自噬减轻七氟醚诱导的凋亡使用蛋白印迹分别检测接受3-MA（10mM）和TMP并暴露于七氟醚后SH-SY5Y细胞中Bax和Bcl-2的表达。结果表明3-MA组的Bax蛋白水平显著高于TMP组（p0.05），而Bcl-2蛋白水平显著低于TMP组（p0.05）（图5D）。图5TMP降低了七氟醚诱导的BACE1和A?表达的增加使用蛋白印迹分析接受TMP并暴露于七氟醚后SH-SY5Y细胞中BACE1和Aβ的表达。结果表明，T组中BACE1和Aβ蛋白的水平显著低于S6h组（p0.05）（图6A）。使用QRT-PCR确定TMP处理并暴露于七氟醚后BACE1和β-APPmRNA的表达。结果表明，T组中BACE1和AβmRNA的水平显著低于S6h组（p0.05）（图6B）。为了进一步观察TMP对七氟醚诱导的BACE1增加的影响，通过免疫荧光染色在SH-SY5Y细胞中定量检测BACE1的表达。结果表明，T组中BACE1阳性细胞（细胞质中含有绿色点）的数量显著低于S6h组（p0.05）（图6C）。图6七氟醚和TMP暴露后Atg5敲减增加了SH-SY5Y细胞中BACE1和A?的表达使用蛋白印迹分析了siRNAAtg5瞬时转染的SH-SY5Y细胞经TMP治疗并暴露于七氟醚后，其BACE1和Aβ的表达。结果表明，siRNAAtg5组中BACE1和Aβ蛋白的水平显著高于siRNANC组（p0.05）（图7A）。通过细胞免疫荧光染色在SH-SY5Y细胞中定量检测BACE1的表达。结果表明，siRNAATG5组中BACE1阳性细胞的数量（在细胞质中含有绿色点）明显高于siRNANC组（p0.05）（图7B）。以上数据表明Atg5可能参与了七氟醚处理后TMP预处理诱导的SH-SY5Y细胞BACE1和Aβ表达增加。图7七氟醚和TMP暴露后GPR50敲减减少SH-SY5Y细胞中pCREB、Atg5和LC3-Ⅱ的表达为了研究GPR50对TMP诱导的BACE1和Aβ升高的影响并进一步明确相关分子和细胞机制，以TMP处理siRNAGPR50瞬时转染的SH-SY5Y细胞然后暴露于七氟醚，使用蛋白质印迹分析来检测CREB，pCREB，Atg5和LC3-Ⅱ的表达。结果表明，siRNAGPR50组的pCREB，Atg5和LC3-Ⅱ蛋白水平明显低于siRNANC组（p0.05）（图8A）。为实时监测自噬的发生，将RFP-GFP-LC3表达质粒瞬时转染的SY5Y细胞以TMP处理并暴露于七氟醚，然后经siRNAGPR50瞬时转染，评估其mRFP-GFP-LC3质粒的表达。结果表明，siRNAGPR50组中各SH-SY5Y细胞中红色点（自溶酶体）和黄色点（自噬体）的数量显著低于siRNANC组（p0.05）（图8B和8C）。基于这些结果，推测GPR50可能促进暴露于七氟醚和TMP后SH-SY5Y细胞中TMP诱导的自噬激活。图8（公益支持仅供医学专业人士参考）讨论
该研究探讨了TMP和七氟醚对SH-SY5Y细胞自噬、凋亡以及BACE1和Aβ的影响，发现暴露于3.4％的七氟醚6小时可能会减弱SH-SY5Y细胞中的自噬，增强细胞凋亡并增加BACE1和Aβ，而TMP可以逆转这种效果。TMP可在SH-SY5Y细胞中通过GPR50/CREB途径增强自噬来减轻七氟醚引起的神经毒性。在某些情况下，自噬可通过抑制细胞凋亡来延长细胞寿命。但是，在另一些情况下，它可以诱导细胞死亡。研究表明，暴露于3.4％的七氟醚5小时不仅可以诱导自噬，还可以激活原代培养的海马神经元细胞的凋亡。Beclin-1和Atg5参与七氟醚诱导的自噬过程。自噬可能在七氟醚引起的神经毒性中起重要作用。然而，目前尚不清楚在SH-SY5Y细胞中TMP对七氟醚诱导的自噬以及BACE1和Aβ的作用。为了解决这个问题，该课题组设计了这项研究，以探讨TMP对七氟醚诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性中自噬的影响以及GPR50和BACE1在其中的作用。研究表明，4.1％的七氟醚治疗6h会引起内质网应激并激活自噬，从而拮抗七氟醚诱导的H4人神经胶质瘤细胞凋亡，这表明自噬可能是预防七氟醚引起的神经毒性的潜在治疗靶点。然而，暴露于3.4~3.6％的七氟醚中6h可以增加衰老大鼠海马神经元的自噬并损害认知功能障碍。该研究表明，暴露于3.4％的七氟醚4小时可显著增强SH-SY5Y细胞中Beclin-1、Atg5和LC3-Ⅱ蛋白的表达。同时，暴露于3.4％的七氟醚4h后，用mRFP-GFP-LC3表达质粒瞬时转染的SH-SY5Y细胞中Beclin-1和Atg5mRNA的表达以及黄色点（自噬体）和红色点（自溶体）的数量增加。但是，暴露于3.4％的七氟醚6小时后，Beclin-1、Atg5和LC3-Ⅱ蛋白水平显著下降。暴露于3.4％的七氟醚4小时和6小时后，Bax蛋白水平显著升高，而Bcl-2蛋白的水平显著降低，并且与七氟醚暴露的持续时间呈线性关系。另外，膜联蛋白V-FITC/PI染色和流式细胞术分析证明，暴露于3.4％的七氟醚4小时和6小时显著增加了SH-SY5Y细胞的凋亡率。两者合计，暴露于3.4％的七氟醚4h可以诱导自噬并激活细胞凋亡，而暴露于3.4％的七氟醚6h则可以抑制自噬并进一步激活SH-SY5Y细胞的凋亡。此外，雷帕霉素可降低暴露于3.4％的七氟醚6小时后Bax蛋白的水平，增加Bcl-2蛋白的水平，表明增强自噬作用可以减弱七氟醚诱导的细胞凋亡。TMP是中药川芎的有效成分之一，在神经保护中起着重要作用，并已在中国缺血性脑血管疾病的临床中使用。DT-是天然存在的丹参素和TMP的新型衍生物，可以作为新型NMDA受体拮抗剂，并通过阻止上游NMDA受体阻止随后的Ca2+内流和下游GSK3β级联反应，从而减轻谷氨酸诱导的兴奋性毒性。TMP通过调节PI3K/Akt/GSK3β信号通路，减轻了白质病变和皮质以及海马的损伤，减轻了氧化损伤，并增强了轴突的生长，从而改善了慢性低灌注大鼠模型的认知缺陷。TMP通过调节pAMPK-mTOR-ULK1信号通路中的pAMPK来增加皮层中的自噬，并通过调节mTOR和Beclin1来提高海马中的神经元自噬。表明TMP的神经保护作用是针对皮质和海马区的化学-再灌注损伤，这可能部分归因于细胞内钙含量的降低，从凋亡转为保护性自噬。另外TMP通过抑制NMDA诱导的细胞凋亡来提高生存力，对SH-SY5Y细胞中的乳酸脱氢酶渗出和细胞内钙超载产生了强烈的抑制作用，从而改善了血管性痴呆大鼠模型的记忆功能障碍。该研究表明，在mRFP-GFP-LC3表达质粒瞬时转染的SH-SY5Y细胞中，TMP可增加Beclin-1、Atg5、LC3-Ⅱ和Bax蛋白的水平，同时降低Bcl-2蛋白水平以及红点（自溶酶体）和黄点（自噬体）的数量。此外，如膜联蛋白VFITC/PI染色和流式细胞仪分析所证实，TMP降低了在暴露于3.4％的七氟醚6小时后SH-SY5Y细胞的凋亡率。这些结果表明，TMP可以促进七氟醚诱导的自噬并抑制七氟醚引起的细胞凋亡。此外3-MA可增加在经TMP处理并暴露于七氟醚后SH-SY5Y细胞中Bax蛋白的水平，表明TMP通过增强自噬来减轻七氟醚诱导的凋亡。β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP）裂解酶1（BACE1）是产生β-淀粉样蛋白的主要神经β-分泌酶，并在溶酶体中降解。自噬-溶酶体系统在维持神经元细胞稳态方面起着关键作用。新生儿接触七氟醚可通过发育中脑内质网（ER）应激信号通路的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP轴提高caspase-3和BACE-1的表达。BACE1是miR-的潜在功能下游靶标，与阿尔茨海默氏病（AD）中的细胞死亡有关，而miR-通过BACE1调节自噬途径产生神经保护作用。该研究通过免疫荧光染色分析发现，暴露于3.4％的七氟醚6小时后，BACE1和Aβ蛋白、BACE1和β-APPmRNA的水平以及BACE1阳性细胞的数量增加，而TMP可逆转上述作用，减轻七氟醚诱导的SH-SY5Y细胞凋亡而产生保护作用。此外，经TMP处理并暴露于七氟醚后，siRNAAtg5瞬时转染SHSY5Y细胞中BACE1和Aβ蛋白的水平以及BACE1阳性细胞的数量增加，表明TMP通过上调Atg5激活自噬而降低了BACE1和Aβ蛋白水平。GPR50，即褪黑素相关受体，与MT1和MT2受体一起是褪黑素受体亚家族的三种亚型之一。用ansiRNA敲低GPR50可抑制神经元自我更新和分化，而GPR50过表达可增加神经元分化，这表明GPR50可能通过notch和wnt/β-catenin信号传导的调节促进NPC的自我更新和神经元分化。CREB对于突触功能和记忆形成至关重要，并且在内质网应激所引起的突触和记忆功能障碍中起重要作用。雷帕霉素预处理可通过上调自噬并激活Akt/CREB、NGF和Nrf2途径，同时抑制p53信号转导，从而防止粘菌素诱导的线粒体功能障碍，胱天蛋白酶激活以及随后的凋亡。雷帕霉素可通过激活自噬，抑制氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡来抑制粘菌素诱导的神经毒性。七氟醚还可诱导miR-下调，IGF-2上调和运动缺陷。此外，七氟醚可诱导海马神经细胞凋亡，降低自噬，增加Bax/Bcl-2比率，降低Beclin1、PSD95和p-CREB的表达，并激活P13K/Akt信号通路。但是，用miR-类似物治疗可显著逆转以上分子变化并改善运动功能。研究表明，miR-可通过抑制PI3K/AKT/CREB信号通路靶向作用于IGT-1，从而减轻七氟醚对衰老大鼠海马星形胶质细胞的抑制作用。该研究表明，经TMP处理并暴露于七氟醚后，瞬时转染siRNAGPR50可降低瞬时转染mRFP-GFP-LC3表达质粒的SH-SY5Y细胞中pCREB、Atg5和LC3-II蛋白表达以及红色点（自溶酶体）和黄色点（自噬体）的数量。综上，GPR50可能参与TMP诱导的自噬激活，而TMP可以通过上调GPR50增强自噬。总而言之，这项研究发现，暴露于3.4％的七氟醚6小时可能会减弱SH-SY5Y细胞自噬，增强细胞凋亡并增加BACE1和Aβ水平，而TMP可逆转此作用。TMP在SH-SY5Y细胞中通过GPR50/CREB途径增强自噬来减轻七氟醚引起的神经毒性。调节自噬以使神经元免于凋亡可能是减轻七氟醚神经毒性作用的新疗法。TMP可能是预防和治疗七氟醚引起的神经毒性的潜在有效药物。翻译：贾俊可审校：陈新忠徐丽丽原始文献XuL,ShenJ,DaiS,SunL,ChenX.TetramethylpyrazineAttenuatedSevoflurane-InducedNeurotoxicitybyEnhancingAutophagythroughGPR50/CREBPathwayinSH-SY5YCells.AmJChinMed.;48(4):-.
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